注意：冷凍保存的細胞非常脆弱。將小瓶置于37°C水浴融化細胞，然后盡快移入培養(yǎng)物(液)中，盡量減少操作。

準備

1.準備纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶(2 μg /cm2，推薦用T-75的培養(yǎng)瓶)。向培養(yǎng)瓶中加入10 ml無菌Dulbecco's磷酸鹽緩沖液（DPBS），然后加入150 μl 纖維連接蛋白原液(1 mg/ml, Sigma cat. no. F1141)。將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中孵育。

2.準備*培養(yǎng)基：用70%的酒精消毒培養(yǎng)基和添加物的外表面，然后放到無菌的地方。在無菌環(huán)境下打開每一個添加物管并用吸管將其加入到基本培養(yǎng)基中。以保證添加物全部加入基本培養(yǎng)基中。

3.吸出纖維連接蛋白溶液并向瓶內(nèi)加入20 ml*培養(yǎng)基。將培養(yǎng)瓶放入超凈臺中，然后準備融化細胞。纖維連接蛋白溶液可以使用兩次。

4.將小瓶放入37°C水浴中，握住并輕輕旋轉(zhuǎn)小瓶直到其內(nèi)細胞*融化。將小瓶立刻移出水浴，擦干，用70%的酒精沖洗小瓶，然后放到無菌環(huán)境中。小心地打開蓋子，注意手指不要碰到里面的螺紋。eppendorf吸管輕輕重懸管內(nèi)容物。

5.將管內(nèi)容物均勻的放入纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中。推薦的接種密度為7,500 cells/cm2。

注意：不推薦在細胞融化后進行稀釋和離心，因為這些操作比培養(yǎng)基中的DMSO殘留物對細胞的傷害更大。需要注意的是，內(nèi)皮細胞接種在纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中能夠促進細胞的帖壁。

6.蓋好培養(yǎng)瓶的蓋子，輕輕地搖動培養(yǎng)瓶以使細胞分布均勻，如需氣體交換則適當放松瓶蓋。

7.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中。

8.為了得到良好的結(jié)果，在培養(yǎng)開始后至少16個小時內(nèi)不要動培養(yǎng)物。第二天更換培養(yǎng)基以去除殘留的DMSO和未貼壁的細胞，然后每隔一天進行如上操作。培養(yǎng)良好的細胞將呈現(xiàn)鵝卵石形或紡錘體形，細胞質(zhì)無顆粒且細胞數(shù)量在培養(yǎng)2-3天后會倍增。[2] 

培養(yǎng)的維持

1.應(yīng)用冰凍的細胞構(gòu)建培養(yǎng)物后，可于次日早晨更換新鮮的含有添加物的培養(yǎng)基。隨后的傳代培養(yǎng)中，每隔48小時更換一次培養(yǎng)基。

2.此后每隔一天更換一次培養(yǎng)基，直到細胞約達到50%融合。

3.一旦細胞達到50%融合，則要每天更換培養(yǎng)基直到細胞大約達到90%融合。

傳代培養(yǎng)：

1.細胞達到90%融合時進行傳代培養(yǎng)。

2.傳代培養(yǎng)的前一天準備纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶(2 μg/cm2)。

3.將培養(yǎng)基，胰酶/EDTA消化液，胰酶中和液和DPBS(磷酸鹽緩沖液) 加熱至室溫。我們不推薦在使用前用37°C水浴加熱試劑和培養(yǎng)基。

4.用DPBS沖洗細胞。

5.用10 ml胰酶/EDTA消化液消化細胞(以T-75培養(yǎng)瓶為例)，直到80%細胞呈現(xiàn)圓形(在顯微鏡下觀察)。立刻加入10 ml 胰酶中和液并輕輕搖動培養(yǎng)瓶。

注意：應(yīng)用ScienCell研究室的胰酶/EDTA消化液能使由于過度消化導致的細胞死亡降到zui小程度。

6.收取細胞并將其移入50ml離心管中。另外用10ml生長培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)瓶以收集殘留的細胞。在顯微鏡下觀察剩余細胞數(shù)量以確定是否收集成功。剩余細胞數(shù)應(yīng)小于5%。

7.以1000轉(zhuǎn)/分（1000rpm）離心收取的細胞懸液5分鐘，然后在生長培養(yǎng)基中重懸細胞。

8. 計數(shù)細胞，然后將它們以推薦的細胞密度接種在新的纖維連接蛋白包被過的培養(yǎng)瓶中

注意：

處理人類來源的產(chǎn)品存在潛在的生物風險。盡管每一株細胞經(jīng)檢測為艾滋病病毒，乙肝病毒，丙肝病毒陰性，但檢測并不能達到100%準確，因此，必須采取適當?shù)谋Ｗo措施以避免無意中的暴露。操作這些產(chǎn)品時請帶手套和安全鏡。不要用嘴吸。我們推薦采用通用的程序來處理人源性產(chǎn)品，從而達到以zui小的預防來對抗污染。